本作剧情设定在1753年至1783年间，场景主要发生在纽约和波士顿。主角是一位叫康纳的英美混血儿，父亲是英国人，母亲是美国原住民。在《刺客信条3》的开局阶段，玩家将体验康纳的父亲，到了第四章就会体验康纳的生活，当时他由莫霍克族（原住纽约州的印第安人）抚养长大。在英国殖民者进攻并烧毁了康纳的村庄后，他最终走上一条对抗暴政（和圣殿骑士）的道路。本作的故事仍然以刺客组织与圣殿骑士的斗争为主线。
由于故事发生在美国独立战争时期，主角将会在游戏过程中遇到众多著名历史人物，乔治·华盛顿、本杰明·富兰克林、查尔斯·李等人都会悉数登场。其中主角与华盛顿的互动将是本作中的核心关系之一，查尔斯·李将是本作的最终BOSS。
